慢病毒整合穩(wěn)定細胞株

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▏ 名詞定義

慢病毒：慢病毒是一種逆轉錄病毒，屬于逆轉錄病毒科。慢病毒表達逆轉錄酶和整合酶，前者將病毒RNA轉化為雙鏈DNA，后者將病毒DNA插入宿主DNA，會隨宿主細胞一起分裂。這一特性可用于將各種基因、突變或治療藥物穩(wěn)定地遞送到細胞中，幾十年來已在研究界得到廣泛應用。一般認為，逆轉錄病毒只感染分裂細胞，而慢病毒則同時感染分裂細胞和非分裂細胞。

野生型慢病毒已被改造成可在實驗室環(huán)境中安全使用的慢病毒載體。這些改造的慢病毒載體具有諸多優(yōu)勢，使其成為多種細胞類型和模型中有用的研究工具。慢病毒載體可以靶向非分裂細胞，能夠在宿主細胞中長期穩(wěn)定表達，并且具有較低的免疫原性。

慢病毒載體： 慢病毒的完整基因組通常8-10kb，由單鏈RNA編碼，包含諸多元件，但是實驗用于包裝的慢病毒，出于安全性的考慮，許多元件都被突變、移除。

圖1 慢病毒的完整基因組元件圖示

1. 包裝基因包含：gag、pol、env
2. 調控基因包含：tat、rev
3. 輔助基因包含：vif、vpr、vpu、nef

Transfer plasmid	LTR	in cis	Long terminal repeat; comprised of a U3-R-U5 structure and are found on each side of the provirus. The U3 (unique 3’) contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. R is the repeat region.
	U3	in cis	Unique 3’; contains sequences necessary for activation of viral genomic RNA transcription. Removal of this region in the 3’ LTR in third-generation plasmids creates self-inactivating viral vectors.
	R	in cis	Repeat region where Tat binds.
	TAR	in cis	Trans-activating response element; found in the R region and acts as the binding site for Tat.
	U5	in cis	Unique 5'; in third-generation plasmids, this region is often removed in 5’ LTRs and replaced with a heterologous promoter (CMV or RSV).
	5' LTR	in cis	Acts as an RNA pol II promoter; the transcript begins, by definition, at the beginning of R, is capped, and proceeds through U5 and the rest of the provirus. Third-generation plasmids use a hybrid 5' LTR with a constitutive promoter such as CMV or RSV.
	3' LTR	in cis	Terminates transcription started by 5' LTR by the addition of a polyA tract just after the R sequence.
	WPRE	in cis	Woodchuck hepatitis virus post‐transcriptional regulatory element; stimulates the expression of transgenes via increased nuclear export.
	RRE	in cis	Rev Response Element; he sequence to which the Rev protein binds.
	Psi (?)	in cis	RNA packaging signal; recognized by nucleocapsid proteins and essential for efficient viral packaging.
	cPPT	in cis	Central polypurine tract; recognition site for proviral DNA synthesis. Increases transduction efficiency and transgene expression.
Packaging plasmid	gag	in trans	Precursor structural protein of the lentiviral particle containing matrix, capsid, and nucleocapsid components.
	pol	in trans	Precursor protein containing reverse transcriptase and integrase components.
	rev	in trans	Binds to the Rev Response Element (RRE) within unspliced and partially spliced transcripts to facilitate nuclear export. Provided by a separate plasmid from gag/pol in third-generation packaging plasmids.
	tat	in trans	Trans-activator; binds TAR to activate transcription from the LTR promoter. Only in first- and second-generation lentiviral plasmids.
Envelope plasmid	env	in trans	The viral envelope gene; typically vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G), an envelope protein with broad tropism used to pseudotype most lentiviral vectors.

▏ 慢病毒載體的演變

針對實驗室中包裝慢病毒，就需要將非必需的組份去除，將必需的組份分離到不同的質粒中確保安全。

因此誕生了主流的4代慢病毒包裝系統(tǒng)：

第一代質粒包括（圖2）：

1.轉移質粒——含有轉基因和野生型 LTR

2.包裝質粒——包含整個病毒基因組（包裝、調控和附屬基因），僅去除了包膜

3.包膜質粒— 含有env

圖2 第一代慢病毒質粒系統(tǒng)

第一代慢病毒質粒缺乏安全性改進以及無法生產具有復制能力的慢病毒（即產生能夠感染細胞并進一步自我復制的病毒顆粒），基本已經廢棄使用了。

第二代質粒包括（圖3）：
1.轉移質粒——含有轉基因和野生型 LTR
2.包裝質粒— 包含gag、pol、tat和rev
3.包膜質粒— 含有env

圖3 第二代慢病毒質粒系統(tǒng)

第二代慢病毒質粒通過去除輔助基因，大大提高了慢病毒載體生產的安全性。第二代質粒包含tat，因為轉移質粒的5' LTR被用作啟動子，而這需要Tat才能激活。

第三代質粒包括（圖4）：

1.轉移質粒——含有轉基因和LTR（嵌合5'LTR）

2.包裝質粒 1 — 包含gag和pol

3.包裝質粒 2 — 包含rev

4.包膜質粒— 含有env

圖4 第三代慢病毒質粒系統(tǒng)

第三代系統(tǒng)在幾個關鍵方面進一步提高了第二代系統(tǒng)的安全性。首先，包裝系統(tǒng)被拆分成兩個質粒。雖然更安全，但該系統(tǒng)使用起來可能更麻煩，并且由于額外的質粒導致病毒滴度較低。其次，第三代系統(tǒng)不需要tat。相反，轉移質粒包含一個與異源啟動子（通常是CMV或RSV）融合的嵌合5'LTR，從而無需Tat的反式激活。

大多數(shù)第三代轉移質粒也含有3' LTR的缺失，使其具有自失活性（SIN）。該缺失在一輪逆轉錄后轉移到5' LTR，從而抑制病毒整合到宿主基因組后全長病毒的轉錄。這種情況在第二代轉移質粒中也常見。

第四代質粒包括（圖5）：

圖5 第四代慢病毒質粒系統(tǒng)

第四代包裝系統(tǒng)針對病毒產量、易用性和安全性進行了優(yōu)化。首先系統(tǒng)采用了四環(huán)素（Tet系統(tǒng)啟動子）轉錄激活表達，其次同樣也采用了Tat反式激活因子驅動病毒的必需成份的高表達，第三gap-pro和vpr-pol被分離到兩個質粒上，這次生產復制型慢病毒需要三次低頻重組，更安全。而滴度，有報道稱，可以達到5*10e8 IFU/mL(未濃縮上清)。

綜上，經過歷代的慢病毒載體的演變升級，現(xiàn)有的第四代包裝系統(tǒng)成為主流的實驗室慢病毒包裝系統(tǒng)，不管是安全性，還是產量，都是比較有保障的。

▏ 包裝的宿主細胞

1.包裝慢病毒需要選擇生產細胞系，常用的生產細胞是HEK293T，相比于HEK293而言，因為HEK293T存在SV40大T抗原，可以使得含有SV40復制起點的質粒進行游離型復制，產生更高的拷貝數(shù)，同時HEK293T具有更高的轉染效率，也能支持更高的病毒滴度。

2.293T/17是293T的亞克隆，同樣也表達SV40大T抗原，因為克隆17在測試中發(fā)現(xiàn)具有更高的轉染性，而被篩選出來。

3.293FT也是293T的衍生細胞，是一種快速生長的變體，同樣也表達SV40大T抗原。

4.Lenti-X 293也是293T的衍生細胞，表達SV40大T抗原，據(jù)報道稱，由Lenti-X 293包裝的慢病毒比293FT多6倍。

5.懸浮293T細胞和各類衍生懸浮細胞，懸浮細胞可以做到更高的密度，可以擴展到生物反應器培養(yǎng)，而且是無血清培養(yǎng)，利于下游的純化和濃縮。

6.穩(wěn)定生產細胞株，在宿主中穩(wěn)定整合了必要的包裝元件，從而簡化了生產流程，病毒的批次穩(wěn)定性好，不需要像瞬轉一樣每次單獨包裝。

圖6 慢病毒包裝圖示

▏ 純化和濃縮

在下一步的慢病毒感染靶點細胞中，所需要的病毒滴度比較高，也比較純，因此收集到的病毒上清液還需要做進一步的純化和濃縮。

病毒顆粒的收集和濃縮方法多種多樣，常見的技術包括離心、過濾、沉淀和免疫捕獲。方法的選擇取決于病毒類型、樣本量以及所需的純度和濃度等因素。一些方法，例如超速離心，可以提供高純度，但可能耗時；而另一些方法，例如聚乙二醇沉淀，速度更快，但可能無法達到相同的純度。較新的技術，例如使用磁性納米粒子的技術，可以快速、高產量地進行濃縮，并且操作最少。

以下是一些關鍵方法的詳細介紹：

1.離心：

差速離心：

該方法使用不同速度的離心，根據(jù)大小和密度將病毒與細胞碎片和其他成分分離。

超速離心：

該技術采用極高的速度使病毒顆?；?，從而實現(xiàn)濃縮和凈化。

離心超濾：

該方法利用具有特定分子量截止值的膜來過濾掉較大的顆粒并濃縮病毒。

2.過濾：

切向流過濾：該方法使用膜將病毒顆粒從大量液體中分離出來，從而實現(xiàn)連續(xù)流動和濃縮。

膜吸附/洗脫：病毒可以吸附到特定的膜過濾器上，然后使用適當?shù)木彌_液洗脫。

3.沉淀：

聚乙二醇（PEG）沉淀：PEG 用于從溶液中沉淀病毒，以便收集和濃縮病毒。

共沉淀：在某些情況下，病毒可以與其他物質（例如蛋白質）共沉淀，以增強濃度。

4.免疫捕獲：

基于抗體的捕獲：可以使用特異性結合病毒的抗體捕獲病毒，從而實現(xiàn)病毒的分離和濃縮。

5.其他方法：

磁性納米粒子：這些納米粒子可用于捕獲和濃縮病毒，提供快速有效的濃縮。

聲學分離：該方法利用聲波根據(jù)大小和密度分離顆粒，可能提供一種溫和有效的病毒濃縮方法。

水基冷凝：這項較新技術正在開發(fā)中，用于對空氣中的病毒進行采樣。

▏ 滴度的檢測

病毒滴度是衡量傳染性病毒顆粒濃度的指標，病毒經過濃縮，滴度比較高，在感染靶細胞之前，需要通過檢測判斷出濃縮后的病毒的滴度。檢測病毒滴度的方法很多，這些方法包括斑塊測定、病灶測定以及量化病毒傳染性或病毒顆粒的各種其他技術。

1. 斑塊測定：

該方法涉及用病毒樣本的連續(xù)稀釋液感染單層宿主細胞。

孵育后，可見的斑塊（細胞裂解或死亡的區(qū)域）形成，并計算斑塊的數(shù)量。

滴度是根據(jù)斑塊數(shù)量、稀釋倍數(shù)和所用病毒量計算得出的。

2. 焦點分析：

與斑塊測定類似，該方法量化了感染后形成的病灶（感染細胞的區(qū)域）的數(shù)量。

通過計數(shù)焦點并考慮稀釋度和體積來確定滴度。

3.其他方法：

qPCR：量化病毒 RNA 或 DNA，提供總病毒顆粒的測量值。

ELISA：檢測病毒抗原，提供量化病毒載量的方法。

流式細胞術：可用于計數(shù)單個感染細胞，尤其是表達熒光標記的細胞。

圖7 慢病毒包裝上清液中存在的產物。物理方法可以測量上清液中釋放的功能性和非功能性顆粒，以及游離衣殼蛋白（例如 p24）。功能性滴定方法專門測量功能性病毒顆粒。

需要注意的是：

1.感染性滴度與物理滴度：

一些方法測量感染性病毒顆粒的數(shù)量（感染滴度），而另一些方法測量病毒顆?？偭浚ㄎ锢淼味龋?，傳染滴度更能反應病毒的感染轉導功能，但是一般檢測傳染滴度所需時間較長，而檢測物理滴度很快，因此有一類方法是建立“感染滴度”和“物理滴度”之間的換算關系。

2.空斑形成單位 (PFU)、轉導單位 (TU) 和感染單位 (IFU) 有什么區(qū)別？哪一個更能反映活性病毒的用量？

1）PFU（空斑形成單位）表示感染性或活病毒的數(shù)量。PFU/ml，通過測量病毒感染后的空斑數(shù)量來校準病毒滴度，反映制劑中有效的病毒數(shù)量。

2）IFU（感染單位）相當于PFU。

3）TU/ml：轉導單位/ml，表示每毫升病毒毒液中具有生物活性的病毒顆粒數(shù)量，即可感染并進入靶細胞的病毒基因組數(shù)量。這是慢病毒的常用計量單位，可以反映制劑中工作病毒的數(shù)量。

IFU 的數(shù)量通常低于TU的數(shù)量，因為并非所有進入細胞的病毒顆粒都能成功引發(fā)有效感染。

▏ 感染靶點細胞

慢病毒轉導涉及將靶基因整合到宿主基因組中，這得益于修飾慢病毒載體內編碼的逆轉錄酶和整合酶，從而實現(xiàn)外源基因的持續(xù)表達。與其他病毒載體不同，慢病毒能夠轉導非分裂細胞，這在基因遞送應用中具有獨特的優(yōu)勢。

在構建穩(wěn)定細胞株過程中，慢病毒侵染宿主細胞，經過反轉錄形成的DNA，部分是游離在細胞中，部分是在整合酶的作用下，將慢病毒載體中的5’LTR到3’LTR的序列整合進宿主的基因組中，在選擇性抗性的篩選下，未整合的細胞會被殺死，活下來的細胞可以擴增以構建穩(wěn)定細胞株，有研究表明：隨著細胞的分裂，大約需要10-14天，未整合的DNA才會降解干凈，同時也是常見抗性的加壓篩選周期。

慢病毒（LV）是一種有包膜的病毒，最常見的是VSV-G，它通過與特定的細胞表面蛋白（比如LDLR）結合，隨后進行膜融合進入細胞，將含有其遺傳信息的病毒RNA注入細胞質。這種單鏈病毒RNA通過逆轉錄轉化為DNA。病毒DNA進入細胞核，并通過病毒整合酶整合到宿主細胞基因組中。

圖8 慢病毒整合宿主基因組的圖示

▏ 實驗中的關鍵考慮因素

1.MOI 選擇：MOI過低會導致轉導效率低下，而MOI過高則可能產生細胞毒性，需要進行MOI滴定實驗以確定最佳感染條件。

2.聚凝胺用途：Polybrene是一種聚陽離子，可以降低病毒與細胞膜之間的電荷排斥，進而提高轉導效率，但如果劑量不當，也可能導致細胞損傷。

3.選擇時機：一旦細胞活力恢復，就實施轉導，盡快保證細胞在增殖活躍期。

4.細胞密度控制：細胞密度過高會增加轉導成本，而密度過低則可能影響效率，建議細胞密度保持在1-2×(10^5)細胞/毫升左右。

5.病毒濃度和滴度：慢病毒的滴度直接影響轉導效率，強調了了解病毒滴度和控制病毒添加的重要性。

6.關于整合：病毒整合的全基因組研究表明，慢病毒最常整合到轉錄活性區(qū)域、近期參與易位事件的區(qū)域以及其他“脆弱”的基因組位置，并且這種偏好在目標物種之間是保守的。盡管已知整合的普遍傾向，但它仍然是隨機的且難以預測。

最后：

由于慢病毒載體能夠整合并長期表達轉基因，因此是有用的研究和臨床工具。常見的應用有：穩(wěn)定細胞株構建、遞送CRISPR文庫、小鼠建模、基因治療等等。

慢病毒轉導是一種穩(wěn)定可靠的基因遞送方法，適用于多種細胞類型，包括通常對其他轉導方法產生抗性的非分裂細胞。通過精心的實驗設計和優(yōu)化，可以顯著提高轉導效率和后續(xù)基因表達的穩(wěn)定性。

▏ 穩(wěn)定細胞株構建服務

科佰生物提供“慢病毒整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細胞株構建服務，利用該系統(tǒng)，我們已經成功構建超過900株穩(wěn)定細胞株的模型，有著豐富的經驗，歡迎溝通咨詢。

		質粒轉染		病毒感染	Flp-FRT系統(tǒng)	轉座子系統(tǒng)	基因編輯
		脂質體	電轉	慢病毒	Flp-FRT系統(tǒng)	轉座子系統(tǒng)	基因編輯
適用細胞		部分細胞	幾乎所有細胞	幾乎所有細胞	內部4種細胞	幾乎所有細胞	部分細胞
轉染/感染效率		低	中	高	高	高	低
隨機整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等級		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因裝載能力		-	-	<4-5k	-	-	-
陽性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包裝	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆篩選	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	單克隆篩選	>3 周	>3 周	>3 周	可選	可選	>3 周
	合計	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作負荷		高	中	中	低	低	高

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